circ_0084043/miR-31-5p调节HMGA1参与动脉粥样硬化作用的机制研究
克华 王, 颖 李, 小璐 任, 磊 王 · 2024
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Description
A peer-reviewed research article from Europe PMC (2024). 目的探究circ_0084043/miR-31-5p调节HMGA1参与动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）作用的具体机制。方法收集2020年9月–2023年9月49例AS患者的颈动脉斑块及血管组织与对应斑块旁正常组织，qRT-PCR检测circ_0084043、miR-31-5p和HMGA1表达。通过CCK-8、克隆形成、划痕、Transwell实验检测氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein, ox-LDL）诱导人血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）增殖、迁移、侵袭能力，通过生物信息学、双荧光素酶报告基因检测验证circ_0084043、miR-31-5p、HMGA1之间的靶向调节关系。建立AS小鼠模型，通过油红O、HE染色观察主动脉病变情况，生化检测静脉血血脂指标，qRT-PCR检测miR-31-5p、HMGA1表达情况，免疫组化检测主动脉HMGA1、α-SMA表达情况。结果AS患者斑块、病变血管组织circ_0084043、HMGA1表达水平升高（P<0.05），miR-31-5p表达水平下降（P<0.05）。circ_0084043与miR-31-5p表达水平呈负相关（r=－0.3855，P=0.0062），HMGA1与circ_0084043表达水平呈正相关（r=0.3317，P=0.0199），与miR-31-5p表达水平呈负相关（r=－0.3351，P=0.0186）。miR-31-5p与circ_0084043、HMGA1存在靶向结合位点。与对照组相比，sh-NC组、scramble组、circ_0084043+miR-31-5p mimics组、miR-31-5p inhibitor+sh-HMGA1组、circ_0084043+sh-HMGA1组增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力升高（P<0.05）；与sh-NC组相比，sh-0084043组则降低（P<0.05）；miR-31-5p mimics组、sh-HMGA1组较scramble组增殖、克隆形成、迁移、侵袭能力下降（P<0.05）。与sh-NC组相比，sh-0084043组主动脉脂质斑块、坏死核心面积减小（P<0.05），TC、TG、LDL-C、HMGA1 mRNA及蛋白、α-SMA表达水平下降（P<0.05），HDL-C、miR-31-5p表达水平上升（P<0.05）。结论circ_0084043通过抑制miR-31-5p提高HMGA1表达促进VSMCs增殖、迁移，推动AS进展。 动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是以动脉壁形成纤维脂肪病变为特征的慢性炎症性疾病，是引发冠状动脉疾病、心肌梗死等疾病的病理基础[1-2]。尽管目前在AS的治疗方面已取得了重大进展，但AS性心血管疾病在全球人口死亡原因中仍占据显著地位[3]。血管主要由血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells, VSMCs）、内皮细胞和成纤维细胞等组成，VSMCs主要位于血管壁的中层，围绕着内皮细胞形成环状排列，具有收缩和舒张的能力，通过控制血管直径和血管壁的张力来调节血压和血流量[4-5]。血管炎症、内皮功能障碍和VSMCs异常增殖/迁移为AS病变发展的重要驱动因素[6]，因此，探究VSMCs参与AS病变的详细机制对AS的防治具有重要的意义。circRNA与线性RNA相较更为稳定和保守，具有调节选择性剪接、亲本基因表达、海绵样吸附miRNA等生物学功能[7-8]，相关研究显示，已有多种circRNAs参与心肌修复、肺动脉高压、AS等多种疾病进展[9-11]。circ_0084043是一种新发现的circRNA，在黑色素瘤细胞中表达上调[12]，但其在AS病变进展中的作用尚不清楚。miR-31-5p与circ_0084043存在结合位点，参与调节肾细胞癌、非小细胞肺癌的迁移过程[13-15]，但在VSMCs迁移中的作用有待研究。HMGA1是HMG家族的成员之一，参与调节多种炎症反应相关基因，与AS斑块形成相关[16]。本次研究通过体内外实验观察circ_0084043/miR-31-5p调节HMGA1参与AS的具体作用机制，现报告如下。 材料与方法 组织样本 收集2020年9月–2023年9月共49例鉴定为Ⅳ～Ⅴ期病变[17]的AS患者颈动脉斑块、病变血管组织与对应斑块旁正常组织。患者男性31例，女性18例，年龄59～78（69.63±6.12）岁。本研究经过宁夏医科大学总医院医学伦理委员会批准（批准号2020-660）。 实验动物 12只雄性6周龄SPF级C57BL/6J ApoE−/−小鼠，体质量（21±2） g，购自宁夏医科大学实验动物中心。实验操作符合3R原则。 实验细胞 人VSMCs（货号BW-5067）、人胚肾细胞HEK 293T（货号BTCC-1003），购自北京博沃尔斯生物科技有限公司。 主要试剂 TRIzol试剂（美国Thermo Fisher，美国），核糖核酸酶R（ribonuclease R, RNase R，瑞必泰，中国），PCR引物（晶莱生物，中国），慢病毒表达载体（珠海舒桐医疗科技，中国），MTT检测试剂盒（囊萤科技，中国），油红O染色试剂盒、HE染色试剂盒（碧云天，中国），总胆固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglyceride, TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C）（南京建成生物工程研究所，中国），HMGA1抗体、α平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin, α-SMA）抗体（Abcam，英国）。 qRT-PCR检测 提取AS患者病变及正常组织、VSMCs总RNA，将组织与细胞的总RNA反转录成cDNA，配制PCR反应体系。反应条件：95 ℃预变性2 min，然后进行40个循环的扩增，每个循环包括95 ℃变性15 s，60 ℃退火、延伸60 s，引物序列见表1。应用2－ΔΔCt法计算基因的表达水平。 表 1Primer sequence引物序列PrimerSequence (5'-3')circ_0084043F: TTCTAGACAGCCGGGGAGTGR: CCAAAACCTTTCTTTCTTGATGGGAmiR-31-5pF: GCCGCAGGCAAGATGCTGGCR: CAGTGCAGGGTCCGAGGT HMGA1 F: AAGGGGCAGACCCAAAAAR: TCCAGTCCCAGAAGGAAGC GAPDH F: ACCACAGTCCATGCCATCACR: TCCACCACCCTGTTGCTGTA U6 F: GCGCGTCGTGAAGCGTTCR: GTGCAGGGTCCGAGGT Primer sequence 引物序列 细胞培养 使用含10%胎牛血清、1%双抗的McCoy's 5A培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养VSMCs。除正常培养的对照组外，其余分组培养基中均添加100
Catalog record
| CREATOR | 克华 王, 颖 李, 小璐 任, 磊 王 |
|---|---|
| YEAR | 2024 |
| COLLECTION | PAPERS |
| FORMAT | TXT |
| FILE SIZE | 19 KB |
| VERSION | 1.0 |
| LICENSE | CC BY 4.0 |
| RIGHTS | CC BY |
| SOURCE | Europe PMC |